Tekuté mycelium lze rozmnožit přenesením malého množství čisté kultury do nového sterilního živného roztoku. Z jedné stříkačky tak můžete připravit pracovní kulturu pro další očkování. Nejdůležitější ale není množství roztoku. Rozhodující je čistota původní kultury, správná sterilizace a práce bez zanesení bakterií nebo plísní.
Při množení se totiž nerozmnožuje pouze mycelium. Pokud je ve výchozí stříkačce nebo nové nádobě neviditelná kontaminace, živný roztok podpoří také její růst.
Než začnete: mateřská a pracovní kultura
Je praktické ponechat si původní ověřenou kulturu jako zálohu a pro běžnou práci vytvořit samostatnou pracovní kulturu. Z původní stříkačky odeberete jen malé množství, zbytek uzavřete a uložíte podle doporučení pro daný druh.
- Výchozí kultura: čisté tekuté mycelium nebo ověřený agarový vzorek.
- Pracovní kultura: nová nádoba určená k přípravě stříkaček a očkování sadby.
- Záloha: část původní kultury, kterou zbytečně neotvíráte.
Každý další přenos zvyšuje riziko kontaminace. Nevytvářejte proto nekonečný řetězec nových kultur z kultur předchozích. Udržujte si ověřený výchozí materiál a označujte datum i číslo přenosu.
Co budete potřebovat
- čistou sklenici s víčkem, injekčním portem a filtračním otvorem,
- vodu a světlý sušený sladový extrakt,
- magnetické míchátko nebo skleněný střep určený k bezpečnému rozmíchání,
- tlakový hrnec či autokláv vhodný pro sterilizaci,
- čisté tekuté mycelium, novou sterilní jehlu a stříkačku,
- 70% isopropylalkohol, rukavice a čisté pracovní místo.
Filtrační otvor umožňuje omezenou výměnu plynů a injekční port dovolí očkování bez otevření víčka. Běžnou sklenici bez těchto prvků byste museli otevřít, čímž výrazně roste riziko zanesení nečistot.
Jednoduchý živný roztok
Pro začátek lze použít světlý sladový extrakt v koncentraci přibližně 1 %. Pro 600 ml roztoku to znamená:
- 600 ml vody,
- 1g světlého sušeného sladového extraktu.
Nižší koncentrace vytváří zpravidla čitelnější roztok a začátečníkovi usnadní sledování kultury. Více živin automaticky neznamená lepší výsledek. Příliš bohatý roztok bývá tmavý, může se při zahřívání více zbarvit a hůře se v něm rozpoznávají změny.
Roztok rozmíchejte, nalijte do sklenice a ponechte dostatek volného prostoru. Sklenici neplňte až po okraj. Pokud používáte magnetické míchátko, vložte ho dovnitř před sterilizací.
1. Sterilizace roztoku
- Zkontrolujte injekční port, filtr a čistotu víčka.
- Víčko uzavřete způsobem doporučeným pro použitou nádobu a tlakové zařízení.
- Menší nádoby s tekutým médiem se běžně sterilizují kolem 121 °C přibližně 20 až 30 minut po dosažení pracovních podmínek. Skutečný čas závisí na objemu, nádobě a zařízení.
- Po skončení nechte tlak přirozeně klesnout a sklenici zcela vychladnout, nejlépe do druhého dne.
Vždy dodržujte návod výrobce tlakového hrnce nebo autoklávu. Zařízení nikdy neotevírejte pod tlakem a nezasahujte do pojistných prvků.
Mírné zežloutnutí roztoku může vzniknout zahříváním. Výrazné ztmavnutí nebo usazeniny mohou znamenat příliš dlouhý cyklus, vysokou koncentraci živin nebo nedokonalé rozpuštění.
2. Očkování nové kultury
Pracujte až po úplném vychladnutí roztoku. Horké médium by mycelium poškodilo.
- Zavřete okna, vypněte ventilátor a očistěte pracovní plochu.
- Umyjte si ruce, nasaďte rukavice a dezinfikujte je.
- Jemně rozmíchejte výchozí stříkačku, aby se shluky mycelia rozptýlily.
- Otřete injekční port nové sklenice 70% isopropylalkoholem a nechte jej oschnout.
- Nasaďte novou sterilní jehlu a nedotýkejte se její sterilní části.
- Přes port vstříkněte malé množství kultury. Pro 500ml sklenici obvykle postačí přibližně 1 až 2 ml čistého tekutého mycelia.
- Jehlu vytáhněte, port znovu očistěte a nádobu označte druhem, datem a zdrojem kultury.
Větší množství výchozí kultury může růst urychlit, ale zároveň zbytečně spotřebujete zásobu a přidáte další kapalinu. Pro úspěch je důležitější čistota než velká dávka.
3. Prorůstání a míchání
Novou kulturu udržujte při teplotě vhodné pro konkrétní druh, zpravidla mimo přímé světlo a slunce. Jemné bělavé obláčky nebo vlákna se mohou objevit během několika dnů, ale rychlost se mezi druhy liší.
- Jednou až dvakrát denně kulturu krátce a jemně promíchejte.
- Magnetická míchačka má rozdělit shluky a okysličit médium, nikoli běžet nepřetržitě vysokou rychlostí.
- Bez míchačky sklenicí opatrně zakružte. Nenamáčejte zbytečně filtr.
- Nádobu během růstu neotvírejte.
Pravidelné promíchání vytváří více menších očkovacích bodů a usnadňuje pozdější natažení kultury do stříkačky.
Jak poznat, že je kultura připravená
Zdravé mycelium obvykle vytváří světlá vlákna a obláčky, které se po promíchání rovnoměrně rozptýlí. Kultura nemusí být zcela zaplněná. Pro pracovní použití je důležitý aktivní růst a dostatek viditelného mycelia.
Samotný vzhled ale nepotvrdí čistotu. Bakterie mohou být přítomné i v roztoku, který vypadá normálně. Proto je nejspolehlivější odebrat malou kapku na sterilní agar a sledovat, zda z ní vyrůstá jednotné mycelium bez cizích kolonií.
Kontrola na agaru
- Připravte sterilní agarovou misku v čistém prostředí.
- Port kultury dezinfikujte a odeberte malý vzorek sterilní stříkačkou.
- Na agar stačí jedna malá kapka.
- Misku uzavřete, označte a inkubujte při teplotě vhodné pro daný druh.
- Teprve po kontrole použijte kulturu k očkování většího množství obilí.
Pokud se objeví oddělené slizké, barevné nebo velmi odlišně rostoucí kolonie, pracovní kulturu nepoužívejte.
Natažení kultury do stříkaček
Před odběrem kulturu krátce promíchejte. Injekční port očistěte, použijte novou sterilní stříkačku s jehlou a natáhněte potřebné množství bez otevření víčka. Každou stříkačku ihned uzavřete sterilním uzávěrem a označte názvem druhu a datem.
Nejbezpečnější je připravovat pouze množství, které v rozumné době využijete. Jednu ověřenou nádobu nerozdělujte opakovaně v nečistém prostředí.
Skladování
Hotovou ověřenou kulturu lze obvykle uchovávat v čisté chladničce přibližně při 2 až 8 °C, pokud konkrétní druh nevyžaduje jiný postup. Kulturu nezmrazujte, chraňte před světlem a označte datum. Dlouhé skladování snižuje vitalitu a zvyšuje význam kontrolního testu před dalším použitím.
Nejčastější chyby
- množení kultury, která nebyla předem ověřena na agaru,
- očkování roztoku, který ještě není úplně vychladlý,
- otevření sklenice místo použití injekčního portu,
- příliš bohatý nebo špatně rozpuštěný živný roztok,
- dlouhá sterilizace vedoucí k výraznému ztmavnutí cukrů,
- dotýkání se sterilní jehly nebo vyčištěného portu,
- mnoho po sobě jdoucích přenosů bez návratu k ověřené kultuře.
Kam pokračovat
Nejprve si přečtěte základní návod ke skladování a použití tekutého mycelia. Hotovou ověřenou kulturu můžete následně použít podle návodu Jak očkovat sterilní obilí tekutým myceliem.
Pro čistou práci se hodí silikonové injekční porty, sterilní jehly, stříkačky, Petriho misky a agar.